背景介紹

自2022年麻省理工學院和哈佛大學Broad研究所的Peter Tsvetkov和Todd R. Golub團隊在《Science》上發表論文“Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins"后，一種由銅引起的細胞死亡新形式—銅死亡逐漸成為科學家的研究熱點。

銅 (Copper, Cu) 作為一種必需的微量營養素，在促進代謝和維持各種基本生物學功能中發揮重要作用。人體內銅的穩態受到嚴格調控，銅穩態失衡會導致代謝異常并對細胞產生毒性作用。銅死亡是一種新發現的由細胞內過量銅引起的程序性細胞死亡形式，不同于其他已知的細胞死亡途徑（如細胞凋亡、壞死、焦亡和鐵死亡），在癌癥治療中顯示出巨大的潛力。

銅代謝過程

生物體系中的銅通常以Cu⁺和Cu²⁺兩種氧化態存在，銅的生物學功能與其在氧化形式和還原形式之間循環的能力密切相關。銅主要可從器官肉類和貝類等食物中獲得，成年人推薦的銅攝入量為0.8~2.4 mg/d用以維持全身銅穩態。然而，過量或不足的銅水平會導致細胞毒性和病理改變。因此，必須將系統銅水平保持在一定的范圍內。

膳食中銅的吸收主要發生在十二指腸和小腸，腸上皮細胞對銅的吸收依賴于銅轉運體1 (Cu transport protein 1, CTR1)，前列腺六段跨膜上皮抗原可作為銅還原酶維持銅的還原狀態，促進CTR1依賴的銅攝取。通過ATP7A介導，銅被轉運進入血液，并與銅伴侶蛋白（銅藍蛋白、血清白蛋白、組氨酸等）結合。銅通過門靜脈系統被運送到肝臟（肝臟是銅穩態的中央控制系統，也是銅儲存和銅排泄的主要器官），由金屬硫蛋白1和2螯合以儲存在肝細胞中。通過ATP7B介導，銅被釋放到血液中，再次與可溶的伴侶蛋白結合，并被運輸到特定的組織和器官。到達其靶組織后，銅催化各種生理過程中的反應，包括線粒體能量產生、酪氨酸和神經遞質代謝、氧化還原穩態和細胞外基質重塑等。過量的銅通過膽汁排泄（內源性銅消除的主要形式）或作為未吸收的金屬離子從糞便中排出。因此，體內銅的狀態受腸道吸收、肝臟儲存和膽汁排泄動態調節。

圖1 正常生理狀態下的銅穩態^[1]

在細胞質中，通過銅伴侶蛋白協調作用，銅主要通過五種途徑調控其分布并發揮生物功能：

a. 以谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 為載體，銅被傳遞給金屬硫蛋白；

b. 抗氧化劑1銅伴侶蛋白在反式高爾基體網絡中將銅轉運到ATP7A和ATP7B，調節銅穩態；

c. 銅被傳遞到細胞核，其中的Sp1鋅指結構作為銅傳感器調節CTR1的表達；

d. 超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白將銅轉運到超氧化物歧化酶1，以清除自由基；

e. 細胞色素C氧化酶銅伴侶蛋白將銅從細胞質運輸到線粒體，參與氧化磷酸化和線粒體功能的維持。當銅的穩態失調時，就會發生嚴重的疾病，如門克斯病和威爾遜病。此外，銅缺乏也存在于阿爾茨海默病、帕金森病、非酒精性脂肪肝、糖尿病和肥胖等疾病中。

銅水平與癌癥的關系

研究表明，乳腺癌、肺癌、胃癌、甲狀腺癌和前列腺癌等癌癥患者腫瘤部位和血清中的銅水平明顯升高^[2]。銅通過結合和激活多個信號通路中的關鍵分子影響腫瘤發生、血管生成、腫瘤復發和轉移。

圖2 銅水平與癌癥的關系^[1]

銅可以作用于受體酪氨酸激酶相關信號通路、磷酸肌醇-3-激酶信號通路和絲裂原活化蛋白激酶信號通路來促進細胞的生長和增殖。此外，銅作為一種“開關"血管生成信使，可以激活腫瘤壞死因子等血管生成因子，刺激血管內皮細胞增殖，穩定缺氧誘導因子-1，促進炎性新生血管的形成。銅還可以通過激活與轉移相關的酶和信號級聯，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。此外，銅還可以調節磷酸二酯酶3B調節腫瘤代謝。因此，銅可以作為抗腫瘤治療的關鍵靶點。

銅離子檢測在胃癌治療中的應用

2023年10月20日，上海市第一人民醫院黃陳教授和范廣建教授團隊在Nature Communications雜志上發表了題為“Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer"的研究論文。研究揭示了METTL16調控胃癌細胞銅死亡的分子機制，闡明乳酰化修飾及m6A修飾在胃癌進展中的重要意義，為胃癌的治療提供新的靶標和策略。

圖3 胃癌組織中銅含量較高，與腫瘤進展有關^[3]。
a.胃癌組織中銅的濃度(綠點)(n=48)明顯高于鄰近正常組織(橙點)(n=48)，(紫色字體為銅濃度均值，P<0.01)。
b. III期胃癌患者的相對銅含量高于I期和II期胃癌患者(P<0.05)。

銅離子檢測試劑盒操作步驟

一、試劑盒組分

二、操作步驟：

1、材料和試劑：

自備材料：酶標儀、蒸餾水、移液器與槍頭、離心機、計時器、濕冰等。

標準品：用蒸餾水連續兩倍梯度稀釋標準品（現配現用）。

Masking Reagent：使用1mL蒸餾水溶解（現配現用）。

Dye Reagent：使用1mL Dye Reagent Diluent溶解Dye Reagent，70℃加熱助溶（現配現用）。

2、樣本處理：

a. 組織樣本：稱取1g組織，加入1mL Assay buffer在濕冰上勻漿，4℃，10000g離心10min，上清液轉移至新離心管中，濕冰上保存待檢測。
b. 細胞/細菌樣本：將細胞/細菌（5×10⁶）收集到離心管中，離心后去掉上清液，加入1mL Assay buffer，超聲處理（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次）后于4℃，10000g離心10min，上清液轉移至新離心管中，濕冰上保存待檢測。
c. 液體樣本：直接檢測。

3、上樣：分別將140uL不同濃度的標準品、樣品加入相應孔中，另設置空白孔加入140uL蒸餾水；每孔分別再加入40uL Reaction Buffer，10uL Masking Reagent以及10uL Dye Reagent，混合均勻，室溫孵育15min。

4、檢測：使用酶標儀測定605nm處的吸光度，擬合標準曲線并計算樣本濃度。

常見問題解答

Q1：該試劑盒檢測組織樣本，對組織樣本的處理有要求嗎？

A1：金屬螯合劑（如EDTA）會干擾此分析，在樣品制備中應避免使用。

Q2：該試劑盒檢測的是Cu⁺還是Cu2⁺還是總銅？

A2：試劑盒檢測的是總銅。

Q3：樣品的稀釋倍數有推薦嗎？

A3：對于未知的樣品，我們建議多做幾個稀釋梯度進行預實驗，以確定合適的稀釋倍數。

Q4：試劑盒操作說明書中既有標準曲線法又有公式法，我應該選擇哪種計算方式？

A4：兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法，建議按照標曲計算，會更加準確。需要注意的是，使用標準曲線法，每次實驗必須重新繪制標準曲線。

Q5：試劑盒中的Dye Reagent稀釋溶解后應該如何保存？

A5：染料(Dye)現配現用，溶解后易氧化變質，建議分裝后4℃，避光保存。

[1] 史曉群, 杜希友.銅死亡機制及相關抗癌藥物[J].生命的化學, 2024, 44(2): 225-232.
[2] Xie J, Yang Y, Gao Y, et al. Cuproptosis: mechanisms andlinks with cancers[J]. Mol Cancer, 2023, 22(1): 46.
[3] Sun L, Zhang Y, Yang B, et al. Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer[J]. Nature Communications, 2023, 14(1).

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