概述

近年來使用3D腫瘤球&腫瘤類器官模型在大型化合物庫中的高通量藥物篩選、檢測單藥或多藥濃度等方面，展現出能夠幫助研究者快速篩選出藥物敏感性強、反應性好、效果優的癌癥適應癥藥物的能力。在2D細胞藥敏活性檢測中，CCK8法應用廣泛，然而在3D腫瘤球&腫瘤藥物敏感活性中，ATP熒光法比CCK8法檢測更準確，今天小愛帶大家了解檢測攻略。

ATP生物發光技術原理

本試劑盒采用生物發光(bioluminescent)法，利用Firefly luciferase（螢火蟲熒光素酶）催化底物—熒光素的轉化，高效利用ATP的能量，發射出光子。發光信號與存在的ATP量呈正比，而ATP與存在于類器官中的細胞數目直接呈正比，有效檢測3D腫瘤球&類器官活性。

本試劑盒為多孔板而設計，是進行自動化高通量篩選(HTS) ，3D腫瘤球&類器官增殖和毒性分析的理想選擇。均質檢測步驟就是將單一試劑直接加入含有類器官培養基的孔板中，無需去除基質膠。

均質檢測的"加樣-混合-檢測" 的操作方案使得3D腫瘤球&類器官裂解和產生的發光信號與存在的ATP量成正比，而ATP量直接與類器官中的細胞數量成正比。特殊的均質檢測方案避免了那些需要多個步驟的ATP檢測方法可能會引入的誤差。

產品組成

注意：產品建議現配現用

產品特點

1）簡化了類器官活性檢測步驟：均質的"加樣-混合-檢測"方案減少了其它同類檢測所需的操作步驟；

2）類器官用量更少：可準確地檢測到低于常用的比色法和熒光法的檢測低限的細胞數。 減少了每個檢測反應所需的細胞數；

3）迅速獲得結果：加入試劑后10min就能獲得數據；

4）可自行選擇檢測方案：可用于多種類型的多孔板操作。可用發光檢測儀或CCD成像設備記錄數據；

5）可連續處理培養板：發光信號穩定，樣品可進行批量處理。

使用方法

1、類器官的準備：

使用適合進行化學發光檢測的96孔板（底和蓋子透明，孔壁不透，推薦貨號：abs7242），每孔接種5uL-10uL類器官基質膠混懸物，放培養箱半小時以上，待凝固后加入100uL類器官培養基（如使用384孔板，每孔接種2.5μL-4μL類器官基質膠混懸物，具體用量視不同類型的384孔板而定），并確保檢測時每孔的細胞數量在5萬個以內（如使用384孔板宜控制在1萬個以內），同時設置不含類器官的基質膠培養液孔作為陰性對照，按照類器官培養的常規方法培養類器官。如有需要，可加入藥物處理類器官。此外，如有必要，也可以設置類器官的濃度梯度，以便后續確定試劑盒的使用效果。

2、試劑準備：

1管凍干粉加入1管10mL buffer里，混勻避光待用。

注：溶解后盡快使用，-80℃，避光保存，有效期一個月。

1）溶解Organoid ATP發光法檢測試劑，如有必要可適當分裝該試劑；

2）按照96孔板每孔100μL（384孔板每孔25μL）的量，取適量Organoid ATP發光法檢測試劑，平衡至室溫。

3、類器官活力檢測：

1）取出類器官培養板在室溫平衡10min（通常不宜超過30min）；

2）將96孔板每孔里的類器官培養基去除，每孔加入100μL Organoid ATP發光法檢測試劑（384孔板每孔25μL）； 注：無需去除基質膠。

3）室溫劇烈振蕩（微孔板恒溫振蕩器，推薦貨號：abs72034）5min使類器官充分裂解；

4）室溫（約25℃）孵育10min，使發光信號趨于穩定；

5）使用具有檢測化學發光功能的多功能酶標儀進行化學發光檢測。請根據儀器要求設置相應的參數，每個孔的檢測時間一般為0.25- 1s或更長時間，具體需根據儀器的檢測靈敏度進行適當的調整；

6）根據化學發光讀數直接計算類器官的相對活力，或根據ATP標準曲線計算出ATP的量從而計算出類器官的相對活力。

注：檢測效果因類器官的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的類器官，在細胞數量達到50,000個后可能會不呈線性相關，但化學發光讀數還是會繼續升高。

常見問題

1、熒光素酶的活性對溫度比較敏感，所以反應前類器官和檢測試劑均需平衡至室溫后再進行測定。檢測試劑請混勻后使用；

2、本試劑盒的檢測試劑中含有熒光素酶，反復凍融會導致其逐漸失活。為取得良好的使用效果，第一次溶解后可適當分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染；

3、待測藥物的溶劑含量較高時可能會干擾熒光素酶反應，從而影響化學發光信號。可以通過設置含有溶劑的類器官培養液對照孔排除溶劑的干擾；

4、檢測時須使用適合于類器官培養的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相鄰孔之間會產生相互干擾；

5、類器官接種密度，以24傳96孔板為例。

傳代前狀態：24孔板，每孔25uL基質膠類器官凝聚物，500uL培養液

傳代比例：類器官1:2傳代

接種方式：24孔板傳96孔板

96孔接種要求：每孔5uL基質膠類器官凝聚物，100uL培養液

接種孔數：24孔板收集3孔類器官傳代，按1:2傳代比例要傳6孔，每孔點膠25uL，總點膠量6*25=150uL，此時傳于96孔板，每孔點膠量5uL，總點孔數150/5=30孔

圖 ICC（膽管癌）類器官96孔鋪板密度圖

檢測案例

1、類器官藥敏-人肝膽管癌(ICC)

結論：人肝膽管癌(ICC)類器官對Oxaliplatin、Lenvatinib、Larotrectinib、Regorafenib不敏感；對Cisplatin、Paclitaxel敏感

2、類器官藥敏-人肺癌

結論：人肺癌類器官對drug1一般敏感； 對drug2敏感

3、類器官藥敏-人胰腺癌

結論：人胰腺癌類器官對Irinotecan、Oxaliplatin一般敏感；對Paclitaxel、Gemcitabine敏感；兩個病人表現出的藥敏效果一致。

4、類器官藥敏-人胰腺癌

結論：人胰腺癌類器官對Larotrectinib、Oclacitinib、Lenvatinib、5-Fluorouracil不敏感一般敏感；兩個病人表現出的藥敏效果一致。

今天講解就到這了，大家如有類器官活力檢測問題，歡迎入群交流哦！

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