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類器官crispr-cas9基因編輯及慢病毒轉染實驗方法

更新時間:2023-08-25      點擊次數:769

近幾年,類器官研究十分火熱,在信號通路機制,藥篩藥敏等研究中對類器官模型需求激增,其中利用crispr-cas9基因編輯技術對類器官進行敲低或敲減來造模是個不錯的實驗方法,今天小愛帶大家來了解crispr-cas9基因編輯技術及慢病毒轉染方法。

crispr基因編輯技術中有三個最為重要的組成部分:crRNA、sgRNA和Cas9蛋白。crRNA與Cas9蛋白形成復合物,sgRNA指引(crRNA/cas9)復合物靶向目的DNA區域定向切割DNA,從而達到基因編輯的目的。


圖1 crispr-cas9基因編輯技術示意圖

 

crispr-cas9基因編輯技術大體上有三種技術路線:All in one質粒轉染法,病毒轉化法,RNP復合物導入法。病毒轉化法是將sgRNA、crRNA和表達cas9蛋白的序列整合進病毒中,再使用病毒感染細胞。相較于質粒轉染法,優點在于sgRNA、crRNA和表達cas9蛋白可以持續存在于細胞中,從而達到一個很高的基因編輯效果。


圖2 慢病毒轉染細胞示意圖

 

很多小伙伴對類器官轉染方法十分好奇,類器官慢病毒轉染和細胞轉染大同小異,主要有以下幾個問題需要注意:

 

1、類器官在進行慢病毒轉染時需不需要從基質膠里解離出來?

考慮到病毒對于基質膠的穿透性及轉染效率,轉染時建議將類器官從基質膠中解離出來,用適當培養基重懸在孔板內進行。

 

2、類器官在進行慢病毒轉染時需不需要消化成單個細胞?

類器官在進行慢病毒轉染時,消化成單個細胞來轉染效率比較高,建議消化成單個細胞進行感染。

 

3、類器官轉染慢病毒多長時間合適?

轉染時間可根據實際實驗情況調整,通常是轉染12-36小時,可以借鑒細胞轉染時間。

 

4、類器官篩選時要不要消化成單個細胞?如果不需要消化,從膠里解離出來就行?還是在基質膠里就行?

類器官篩選不需要消化成單個細胞,在基質膠里就可以篩選,大部分的藥物都可以穿透基質膠,作用到類器官上。

 

以下給大家整理了類器官轉染步驟:

 

1)收集類器官并消化成單個細胞后,按2×105/孔鋪到24孔板中(細胞密度可以自行摸索);
2)用含有6μg/ml polybrene(polybrene的濃度可以自行摸索)的1ml新鮮類器官培養基替換原培養基,加入適量病毒懸液,37℃孵育;
3)(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入1ml新鮮培養基以稀釋polybrene;
4)繼續培養12-36小時后,如有少量細胞貼壁,可用槍頭輕柔吹打下來,混勻,將細胞培養基混懸液收集至離心管中(一般是6-8孔為一組)。300g 4℃ 富集離心5min后移去上清,添加1ml左右類器官傳代培養緩沖液(abs9730)轉移到1.5mlEP管,重新重懸離心;
5)觀察收集到的組織體積,添加25倍組織體積的基質膠(abs9495)重懸混勻(金屬冰盒或冰上操作);
6)以24孔細胞培養板為例,每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板(金屬冰盒或冰上操作),將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15min成膠,添加500-750μl 類器官培養基(恢復室溫)進行培養;
7)待類器官出現明顯增殖現象(一般需要2-3天),更換含有藥物的類器官培養基進行篩選(如嘌呤霉素等),沒有轉染成功的類器官將會裂解凋亡,從而篩出成功轉染的類器官;

(* 圖源網絡,僅供學習參考用)

 

今天講解就到這了,大家如有實驗問題,歡迎公眾號后臺交流哦!


貨號

品名

規格

abs9495

基質膠(低因子、無酚紅)

1.5ml*4/ 1.5ml*8

abs9730

類器官傳代培養緩沖液

250ml/ 250ml

abs9444

Organotial人肝癌類器官培養基試劑盒

1kit

abs9445

Organotial人結直腸癌類器官培養基試劑盒

1kit

abs9443

Organotial人肺癌類器官培養基試劑盒

1kit

abs9449

Organotial人胃癌類器官培養基試劑盒

1kit

abs9447

Organotial人胰腺癌類器官培養基試劑盒

1kit

abs9589

Organotial人鼻咽癌類器官培養基試劑盒

1kit

abs9739

Organotial人腦膠質瘤類器官培養基試劑盒

1kit

abs9446

Organotial人乳腺癌類器官培養基試劑盒

1kit

abs9514

Organotial小鼠正常腸類器官培養基試劑盒

1kit

abs9516

Organotial小鼠正常肝類器官培養基試劑盒

1kit

abs9515

Organotial小鼠正常肺類器官培養基試劑盒

1kit

abs9643

Organotial小鼠正常胃類器官培養基試劑盒

1kit

abs9583

Organotial豬子宮內膜類器官培養基試劑盒

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abs9591

Organotial奶牛乳腺類器官培養基試劑盒

1kit

 

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