概述

DHA是一種半合成衍生物，是C15H22O?的主要活性代謝產物。本研究的目的是在體內和體外模型中研究DHA對潰瘍性結腸炎（UC）的影響。體重、存活率、結腸長度和疾病活動指數評分用于評估結腸炎的嚴重程度。采用逆轉錄定量聚合酶鏈反應和酶聯免疫吸附試驗檢測細胞因子白細胞介素1、白細胞介素1β、白細胞介素4、白細胞介素6、白細胞介素10、白細胞介素12和腫瘤壞死因子α的表達。western blot分析檢測Janus激酶2（JAK2）和信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）的表達，以及JAK2（p-JAK2）和STAT3（p-STAT3）的磷酸化。westernblot分析和免疫組化檢測緊密連接蛋白的表達。

此篇文章發現右旋糖酐硫酸鈉（DSS）+DHA組小鼠的體重和結腸長度分別顯著低于DSS組和長于DSS組。與DSS組相比，DSS+DHA和DSS+5-氨基水楊酸（5-ASA）組中IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的表達降低，而IL-4和IL-10的表達顯著上調。DHA顯著增加閉塞帶-1和閉塞素的表達。Western blot分析和/或免疫組織化學染色分析表明，DSS+DHA和DSS+5-ASA組中JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3的表達顯著低于DSS組。DHA對UC有特殊的治療作用。DHA的抗炎機制與阻斷JAK2/STAT3信號通路有關。這些發現為DHA可能是一種有用的藥物提供了證據，并有望成為治療人類UC的一種有希望的新療法。

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研究背景

炎癥性腸病（IBD）是一種以慢性和復發性炎癥為特征的免疫介導疾病，包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病，癥狀為腹痛、腹瀉、大便出血和體重減輕。其發病率和流行率在全球范圍內不斷上升。其中UC以粘膜炎癥復發為特征，病變主要位于直腸和近端結腸。目前UC的治療干預主要集中在誘導和維持臨床緩解。IBD的確切病因尚不清楚。，腸道細菌、生活習慣和遺傳因素都會導致疾病的發展。目前用于治療UC的藥物主要包括氨基水楊酸（ASA）、糖皮質激素、免疫抑制劑和生物制品。由于療程較長，他們的治療通常受到不良事件的限制。當停止治療時，疾病經常復發。此外，這些藥物并非對所有患者都有效。這種疾病需要新的更有效的治療方法。

雙氫C15H22O?（DHA）是一種半合成衍生物，是C15H22O?的主要活性代謝產物，C15H22O?是從中草藥青蒿中分離出來的天然產物。DHA是*且耐受性良好的藥物，具有療效高、副作用低、成本低等優點。DHA是C15H22O?家族的衍生物，也是世界衛生組織推薦的一線抗瘧藥物之一。DHA已被證明具有抗病毒和抗菌作用，也是一種有效的免疫調節劑。

DHA具有抗炎和抗腫瘤功能。先前的一份報告表明，DHA通過調節激活IBD進展的信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）和核因子κB（NF-κB）信號通路，抑制黑色素瘤細胞、食管癌細胞和其他惡性腫瘤細胞的生長。

在本研究中，我們假設DHA可能通過類似的機制抑制UC的進展[10]。雖然已經應用了一些治療方法來控制IBD的發展，但一些IBD患者仍可能發展為結直腸癌。IBD目前被認為是一種自身免疫性疾病，如果不能有效治療，可能會發展為結腸癌。由于IBD的治療需要長期藥物治療，DHA可能是治療UC的一種有希望的候選藥物。在此，我們研究了DHA對右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導的UC體內模型的影響，并探討了其潛在機制，其中涉及Janus激酶2（JAK2）/STAT3信號通路。

實驗過程

1. 小鼠實驗性結腸炎模型的建立

2. 結腸的組織學分析

3. 細胞培養

4. 細胞活力測定

5. Annexin V染色

6. ELISA檢測

7. 免疫組化染色

8. 蛋白質印跡分析

9. RNA提取與實時定量PCR

10. 統計分析

實驗結果

1.DHA改善DSS誘導的體內結腸炎

為了闡明DHA在慢性結腸炎中的作用，我們觀察了DHA對DSS誘導的慢性結腸炎的影響（圖1A）。與DSS誘導的結腸炎小鼠相比，用DHA和5-ASA治療的小鼠顯示出顯著減少的炎癥反應。DSS組小鼠的體重顯著低于對照組。但是20只老鼠的體重?mg/kg DHA和10?mg/kg 5-ASA組顯著高于DSS組（圖1B）。DSS誘導的慢性結腸炎可使小鼠結腸縮短。DAI是評價疾病活動性的重要指標。根據從體重減輕、腹瀉和血便百分比中獲得的DAI，DSS組的DAI顯著高于對照組，而DSS+DHA組和DSS+5-ASA組的DAI低于DSS組（圖1C）。DSS組的結腸長度明顯短于對照組。DSS+DHA組和DSS+5-ASA組的結腸縮短顯著減少（圖1D，E）。

圖1.DHA對DSS誘導的結腸炎臨床癥狀的影響?

（A）DSS誘導小鼠慢性結腸炎的動物模型。（B）體重變化。（C）DAI評分計算為第51天體重減輕評分、腹瀉評分和糞便血評分的平均值。（D）UC模型中收集的冒號。（E）四組結腸長度的差異。數據以平均值±標準差表示與對照組相比，P<0.001與DSS組相比，P<0.01，P<0.001。N?=?10

未經治療的結腸炎動物結腸切片的組織學評估表明，DSS誘導的結腸炎的特征是粘膜結構喪失、結腸壁增厚、潰瘍形成和結腸粘膜廣泛的炎性細胞浸潤（圖2A）。DHA和5-ASA治療可抑制這些病理癥狀和組織的逐漸恢復，減少粘膜和粘膜下層的炎性細胞浸潤，并保持結腸粘膜的完整性（圖2A）。未經治療的結腸炎小鼠用肉眼觀察到局部結腸粘膜潰瘍、充血和水腫，而經DHA和5-ASA治療的結腸炎小鼠的這些癥狀有所改善（圖2A）。此外，DSS+DHA組和DSS+5-ASA組的組織學評分顯著低于DSS組（圖2B）。總的來說，這些結果為DHA在小鼠UC治療中的保護作用提供了第一個證據。

圖2.DHA對DSS誘導的結腸炎結腸的影響?

（A）不同組結腸切片的代表性H&E染色圖像。比例尺：200?μm.（B）不同組的組織學評分。（C）四組小鼠結腸切片中JAK2的免疫組織化學染色。（D）四組小鼠結腸切片的免疫組織化學ZO-1染色。（E）臨床IBD患者結腸活檢中ZO-1和JAK2的免疫組織化學染色。數據以平均值±標準差表示與對照組相比，P<0.01與DSS組相比，P<0.05，P<0.01。N?=?5.

2.DHA增加腸緊密連接蛋白和ZO-1的蛋白表達

緊密連接蛋白中閉塞素和ZO-1的表達與IBD的發生和發展密切相關[32]。為了研究DHA是否能修復慢性結腸炎小鼠腸道中受損的緊密連接蛋白，采用western blot分析檢測閉塞素和ZO-1的表達。如圖3A所示，DSS組中閉塞素和ZO-1的蛋白表達水平顯著低于對照組。與DSS組相比，DHA組和5-ASA組的閉塞素和ZO-1的蛋白質表達水平顯著增加（圖3C，D）。逆轉錄（RT）-qPCR（圖3B）和免疫組織化學染色（圖2D）結果表明，DSS+DHA和DSS+5-ASA組的ZO-1表達在mRNA水平和蛋白質水平上均強于DSS組。為了驗證免疫組化結果的準確性，我們選擇了一名臨床IBD患者的腸組織進行ZO-1免疫組化染色，并獲得了類似的結果。這些結果表明，DHA增加了慢性結腸炎小鼠腸道緊密連接蛋白occludin和ZO-1的蛋白表達。

圖3.DHA對DSS誘導的結腸炎小鼠結腸組織緊密連接蛋白的影響

（A）ZO-1和閉塞蛋白表達的Western blot分析。（B）四組小鼠結腸組織勻漿中ZO-1mRNA的相對表達。（C，D）ZO-1和閉塞蛋白的定量分析。數據以平均值±標準差表示與對照組相比，P<0.01與DSS組相比，P<0.01。

3.DHA保護與THP-1細胞共同培養的炎癥模型中Caco-2細胞的細胞活力

為了探討DHA是否對炎癥環境中的腸粘膜具有保護作用，我們建立了一個在穩態或炎癥狀態下腸內分化的Caco-2細胞和分化的THP-1細胞的體外共培養模型。CCK-8檢測結果顯示，Caco-2細胞的活力在20或40%之間?µM DHA組高于模型組（圖4C）。流式細胞儀檢測結果顯示，20、40周齡組Caco-2細胞凋亡率明顯高于對照組?µM DHA組與模型組相比無統計學意義（圖4A，B）。DHA處理的Caco-2細胞的存活率高于模型組，表明DHA對體外模擬的腸粘膜具有保護作用。然而，在20個細胞中，Caco-2細胞的生存能力?µM DHA組高于40%組?µM DHA組，表明20?µM DHA保護的Caco-2細胞模型比40μM DHA更有效地模擬腸粘膜?µM DHA。

圖4.DHA對體外共培養模型的影響?

（A，B）四組體外共培養炎癥模型中Caco-2細胞的凋亡率。（C）四組體外共培養炎癥模型中Caco-2細胞的細胞活力。（D-I）四組體外共培養炎癥模型基底外側側細胞上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α的水平。數據以平均值±標準差表示與對照組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001#與模型組比較，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

4.在體外共培養炎癥模型中，DHA抑制THP-1巨噬細胞產生IL-1β、IL-6和IL-17，并促進IL-4和IL-10的產生

為了探討DHA是否減少Caco-2細胞和THP-1細胞體外共培養模型中模擬的炎癥反應，使用ELISA試劑盒測定了在體外炎癥模型中共培養的基底外側側巨噬細胞（分化的THP-1細胞）產生IL-1β、IL-6、IL-17、IL-4、IL-10和TNF-α的情況。DHA（20或40?µM）預處理減少了IL-lβ、IL-6和IL-17的產生（圖4D、F、H），而DHA增加了IL-4和IL-10的產生（圖4E、G）。有趣的是，在每個實驗組的共同培養炎癥模型的基底外側，TNF-α水平沒有顯著差異（圖4I）。這些結果表明，DHA增加了體外共培養炎癥模型中抗炎細胞因子的水平，降低了促炎細胞因子的水平，表明DHA可以降低體外共培養炎癥模型中的炎癥反應。

5.DHA對細胞因子表達的影響

為了驗證DHA對DSS誘導的小鼠慢性結腸炎炎癥反應的影響，我們通過ELISA和RT-qPCR測定了細胞因子的表達。ELISA結果顯示，DSS組中的IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α水平高于對照組，但DHA處理后顯著降低（圖5A、C、E、F）。DSS+DHA組的IL-4和IL-10水平顯著低于對照組，但高于DSS組（圖5B，D）。RT-qPCR結果顯示，DHA和5-ASA組中IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的mRNA水平顯著高于對照組，但低于DSS組（圖5G、H、J）。另一方面，與DSS組相比，DHA處理顯著刺激IL-10 mRNA的表達（圖5I）。這些結果表明，DHA抑制UC促炎細胞因子的表達，促進抗炎細胞因子的表達。

圖5.DHA對DSS誘導的結腸炎細胞因子產生和表達的影響?

（A–F）四組小鼠外周血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α的濃度。（G–J）四組小鼠結腸組織勻漿中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-αmRNA的相對表達。數據以平均值±標準差表示*與對照組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001與DSS組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。.

6.DHA對DSS誘導的小鼠慢性結腸炎中JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達的影響

如圖6A、B、E所示，與DSS組相比，DHA顯著降低JAK2和STAT3的表達。此外，我們對JAK2進行了免疫組織化學染色，并獲得了類似的結果（圖2C）。為了驗證免疫組化結果的準確性，我們選擇臨床IBD患者的腸組織進行JAK2免疫組化染色（圖2E），并獲得與DSS組相似的結果。實驗性結腸炎小鼠治療后，p-JAK2/JAK2比率降低（圖6D）。然而，DSS組小鼠結腸粘膜中磷酸化JAK2（圖6C）和磷酸化STAT3（圖6F）的水平上調，這與對照組、DSS+DHA組和DSS+5-ASA組相反。p-JAK2/JAK2（圖6D）和p-STAT3/STAT3（圖6G）的比率反映了p-JAK2和p-STAT3的水平，表明DHA抑制了JAK2和STAT3的磷酸化。

圖6.DHA對信號轉導子和轉錄激活子JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的影響

（A）AK2、p-JAK3、STAT3和p-STAT3蛋白的蛋白質印跡分析。（B）JAK2蛋白的定量分析。（C）p-JAK2蛋白的定量分析。（D）p-JAK2/JAK2的比值。（E）STAT3蛋白的定量分析。（F） p-STAT3蛋白的定量分析。（G） p-STAT3/STAT3的比率。數據以平均值±標準差表示與對照組相比，P<0.05，P<0.01與DSS組相比，P<0.05，P<0.01。

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