之前的幾期課堂講座給大家分享了ELISA實驗的原理，操作步驟以及實驗中的常見問題（感興趣的小伙伴可以去視頻專區收看），近期又收到部分小伙伴的反饋問題，主要集中在數據處理上。小編看了也覺得比較可惜，整個ELISA實驗做得不錯，可惜在后的數據處理上犯了錯誤，直接導致實驗結果出了大問題，可謂功虧一簣。接下跟著小編進行一次實戰案例的分析，詳細了解一下愛必信ELISA試劑盒的數據處理過程吧~

話不多說，先上圖：

圖一. 客戶提供原始OD值圖（涉及未發表數據，部分隱去，部分略作處理）

圖二. 客戶處理的標準曲線圖
 

客戶反饋，部分數據OD出現負值，無法處理，覺得試劑盒有問題。小編接到這個case之后，簡單的看了一下客戶的數據，就發現幾個明顯的數據處理問題，而根據客戶的原始OD數據，初步判斷，試劑盒是正常的，并且實驗數據還比較可靠。不知道是否有聰明的小伙伴已經從這個數據中發現了問題呢？沒關系，跟著小編一起來抽絲剝繭的詳細分析一下吧~
 

1. OD值出現負值

大量樣品孔的讀值為負數，但接近零點，小編看了一下客戶標曲的0點OD值接近0，初步判斷客戶是用空白孔進行校準，但空白孔由于操作污染等原因，OD值偏高，進而導致樣品孔OD值為負。跟客戶溝通之后，確實是進行了空白孔校準。

溝通之后，確認原始空白孔讀值為0.0962，明顯偏高，正常OD450的空白孔讀值應為0.06左右。

在這里，小編建議有條件的小伙伴，盡量要用我們推薦的雙波長校正法，使用570或630nm波長進行校正，OD450 - OD570/630即為校正后的OD值，可直接用于計算，也可根據數據質量，再進行空白校正。如沒有雙波長的酶標儀，讀取OD450數據后，應先判斷數據質量，再進行空白校正。
 

小編將空白校正進行補回，得到的OD450原始數據如下：至此，樣品孔數據出現負值這一問題解決。

圖三. 經還原處理的OD450原始數據圖

2. 標曲擬合問題

處理完了負值問題，還有一個很明顯的問題就是，客戶的標曲擬合問題。我們這款試劑盒（Mouse TNF alpha ELISA Kit，abs520010）標曲高點是2000 pg/ml，客戶給我的截圖（圖二）只到250 pg/ml，再仔細研究一下，發現客戶的擬合方式用的竟然是直線擬合。跟客戶溝通之后，確認原因，客戶選擇直線擬合，高點不符合擬合方式，R2值過低，所以客戶自己把上面高濃度的點去掉了，只選取到250 pg/ml，進行直線擬合。在這里，小編強調一下， 愛必信ELISA試劑盒推薦擬合方式為四參數擬合，四參數擬合，四參數擬合，重要的事情說三遍。不要再用其他稀奇古怪的擬合方式進行擬合啦。就像這個客戶犯的錯誤，雖然看似250 pg/ml以下的點可以用直線擬合，但是表達含量較高的樣品，OD值高時，就不符合他擬合的這條直線了，會導致結果出現嚴重偏差。由于0孔出現問題，小編在擬合標曲時，將OD值低的孔作為空白孔，TNF-α在正常樣品中表達含量極低，可視為0，擬合曲線如下：

圖四. 四參數擬合的曲線圖及方程
 

回歸計算之后得到樣品濃度，部分無法計算出的樣品孔，表達含量低于0點，按0計算即可。

本期ELISA實戰案例解析就到這里了，希望對各位小伙伴們有所幫助。大家在平時的實驗中遇到什么問題也可以聯系我們，小編匯總之后，盡力為大家解答~

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